STED显微镜：超高分辨率不再是梦想（上）

wzf28 · 发表于 2014-12-1 00:02:01

古人云：工欲善其事，必先利其器，这句话用来形容光学显微镜技术的发展真是再合适不过了。自从17世纪列文虎克用光学显微镜首次向我们展示精彩的微观世界以来，全世界的科学家们就从来没有停止过发展显微镜技术的脚步。在300多年后的今天，获得今年诺贝尔化学奖的德国物理学家黑尔，用他发明的STED显微镜再次让这一古老的技术焕发出新的生机。

阿贝极限无法逾越？斯特凡•黑尔（Stefan Hell）1962年出生于罗马尼亚，他在那里度过了青少年时光，后随父母移居西德。1981年，黑尔进入著名的海德堡大学，在那里获得物理博士学位，又留下来进行了一段时间的研究工作。在海德堡大学的时候，黑尔就开始思考一个重要的问题，那就是能否让光学显微镜突破阿贝极限，获得更高的分辨率。
什么是阿贝极限呢？19世纪后期，随着科技的进步，人们越来越渴望更加深入地认识微观世界。为此，全世界的研究人员都怀着极大的热情在提高光学显微镜的放大倍率。然而德国物理学家恩斯特•阿贝却给大家泼了一盆冷水：即便你把镜片磨得再好，玻璃炼得再纯，也别指望光学显微镜能够看到无限小的物体。他说，两个物体的间距小于200纳米就分不清了。这是为什么呢？
刚开始学习光学时，老师告诉我们，光是沿着直线传播的，遇到障碍物就会被阻挡。然而光作为一种波，和其他的波一样，在遇到障碍物时可以绕过它继续前进，这样的现象被称为衍射。不过只有当障碍物的尺寸与光的波长接近时，光的衍射才会非常明显。可见光的波长只有几百纳米，而肉眼可见的物体都比这大多了，因此在绝大部分情况下，我们只看见光在沿着直线传播。例如在一个不透明的挡板上刻出一条狭长的缝隙，让平行光线照射到挡板上，在挡板后方的屏幕上，就会出现一条明亮的条纹，它的宽度与缝隙的宽度完全相同。如果把狭缝的宽度减小到0.1毫米或者更小，我们会发现，在这条明亮条纹的两侧，又多出了许多亮条纹；把挡板移走，这些亮条纹也随之消失。显然，这些多出来的亮条纹也来自挡板上的狭缝，它们正是衍射的杰作。
刚才我们提到，照射到狭缝上的光线是平行的，如果衍射没有发生，穿过狭缝的光线也将是“井水不犯河水”，继续平行向前。然而衍射发生时，经过狭缝边缘的光有一部分向狭缝的另一边缘发散，与狭缝对面边缘发散的光相遇了。这两束光相遇后，并不是简单地变成了更加明亮的一束光，而是根据它们路程的差别，有的变得更加明亮，有的反而变得更暗，这样的现象被称为干涉。干涉就是屏幕上多出许多明暗交替条纹的原因。

图1 一束平行光照射到不透明挡板上的狭缝，没有发生衍射时（左），仅在狭缝范围内的光可以穿过狭缝；由于发生了衍射（右），一部分光绕过狭缝向其两侧发散并发生干涉。

当我们用光学显微镜观察样品时，从光源发出的光在穿过样品以及经过透镜的边缘时都会发生衍射。由于衍射的存在，即便是一个大小可以忽略的点，在显微镜中也会看到它的周围有一系列同心的衍射光环，这样的图案被称为艾里斑。艾里斑的出现给我们带来了很大的麻烦。
光从两个点分别发出时，无论它们离得多近，只要没有衍射，那么总可以清晰地将这两个点分辨开来。可是由于衍射的存在，我们看到的是两个艾里斑。如果这两个点离得比较远，我们依旧可以将它们分辨开，但当这两个点相互靠近到一定程度时，明明还没有挨在一起，双方的艾里斑已经“打成一片”了。这样一来，我们很难弄清楚看到的到底是一个点还是两个点。因此，当物体的间隔小到一定程度，我们即便借助光学显微镜也无法看清了。

图2 左：由于衍射现象，我们无法看到一个无限小的点，而只能看到它的艾里斑。右：如果两个点相距过近，它们的艾里斑部分相互重叠，我们将无法分辨出这两个点。

那么我们到底能够看清多小的结构呢？阿贝通过分析指出，如果两个点的距离小于可见光的波长的一半，那么由于它们的艾里斑互相重叠，我们将无法将这两个点辨认清楚。可见光中波长最短的蓝紫光波长约400纳米，这意味着光学显微镜能分辨出的物体最小距离约200纳米。200纳米因此成为光学显微镜能够达到的最高分辨率，也就是我们通常所说的阿贝极限。因此，凭借光学显微镜，我们无法看到微观世界中内容很丰富的一部分。例如，细胞的许多内部结构以及大部分病毒的尺寸，都在200纳米左右或者更小，光学显微镜就无能为力了。
怎样才能看到更小的结构？那么怎样才能看清更小的结构呢？根据阿贝极限，要获得更高的分辨率，最简单的办法就是让波长变得更短。根据这个思路，电子显微镜应运而生。电子也具有波的性质，它的波长比光小得多。因此，我们可以轻而易举地看到光学显微镜看不到的结构，例如病毒。除了电子显微镜，还有其他许多技术也可以帮助我们看到更小的结构。例如原子力显微镜用一根很小的探针去感知样品表面的结构，它并不依赖于光学原理，自然不受阿贝极限的束缚。
电子显微镜虽然可以轻松地看到尺寸更小的物体，但它的一大局限是不仅准备样品繁琐，而且通常必须置于高真空环境中观察，这使得观察活体组织器官几乎不可能。其他的显微技术，例如原子力显微镜，也并非完美无瑕。这些缺点使得许多科学家尤其是生物和医学领域的研究人员，怀念起光学显微镜的种种便利之处，还是希望能通过光学显微镜看到更小的结构。黑尔正是这些科学家中的一员。然而，100多年前出现的阿贝极限又是一道难以逾越的鸿沟，因此当黑尔提出超越阿贝极限的设想时，他的同事纷纷向他投来怀疑的目光。芬兰图尔库大学的一位教授对黑尔的想法倒是很感兴趣，向他发出了邀请。于是在1993年，他离开德国前往芬兰，继续突破阿贝极限的探索。
黑尔的巧妙构思在图尔库大学期间，黑尔的脑海中浮现出一个提高光学显微镜分辨率的大胆想法，也就是后来的STED显微镜的雏形。根据阿贝极限，两个观察对象相距小于200纳米时就无法被分辨开。黑尔想到，如果把显微镜光源的光斑直径减到比这个距离还要小，那么就不可能将这两个观察对象同时照亮。也就是说，当我们照射并观察第一个点时，第二个点并不会发光，自然不会产生艾里斑影响我们观察第一个点。接下来，我们移动光斑，让第二个点被照亮。这个时候第一个点又不在光斑的照明范围之内了，同样不会干扰我们对第二个点的观察。如果样品中还有更多的点，我们只需要将光斑逐步移动过去，就可以将它们一个一个看清楚。通过这种“以时间换空间”的设计，黑尔巧妙地绕开了阿贝极限的束缚，将光学显微镜的分辨率大大提高。

图3 STED显微镜的工作原理。
上：由于物体中各个点的距离小于阿贝极限的200纳米，普通光学显微镜无法将它们分辨清楚。
左下：若显微镜的光斑直径小于200纳米，则用这样的光斑观察其中一个点时，相邻的点不会干扰对其的观察。右下：用这样的光斑扫描整个样品表面，就可以看清样品的全部结构[1]。

黑尔的构思虽然巧妙，可实现起来绝非易事。这个设想的关键是让光源的光斑直径比阿贝提出的分辨率极限200纳米还要小，然而我们通常能够得到的光斑尺寸总是会比200纳米大。如果不能实现尺寸如此之小的光斑，突破阿贝极限终究不过是纸上谈兵而已。
黑尔自然也意识到了这个极具挑战性的技术难题。经过苦苦思索，他想到了一种可能的解决方案，那就是利用光学显微镜中的一种特殊的类型——荧光显微镜。那么什么是荧光显微镜，黑尔又是如何利用荧光显微镜实现自己突破阿贝极限的构想呢？敬请关注本文的下半部分。
参考文献和注释：
[1] http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/research/methods/STED.html

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