| 作者： 陈勇 ，胡军祥 ，章元明 http://www.handsurgery.cn 基础研究 2005年7月15日 【摘要】 目的：研究超低温慢速冻存和玻璃化冻存对大鼠骨髓细胞的DNA合成功能的影响。方法：采用 H—TdR掺入的方法对慢速和玻璃化冻存后的大鼠骨髓细胞DAN合成功能进行比较。结果：慢速冻存1 d、 5 d、10 d、20 d与新鲜对照相比，在DAN 合成功能上差异无显著性；而玻璃化冻存组与慢速冻存组相比，短期差异无显著性，10 d后，每分钟脉冲数(c )值显著下降(P<0．01)。结论：常规慢速冻存后的骨髓细胞损伤较小．DNA合成水平较高；玻璃化冻存在短期内具有一定的可行性。 【关键词】 大鼠；骨髓细胞；慢速冻存；玻璃化冻存；DNA合成 【Abstract】 目的：研究超低温慢速冻存和玻璃化冻存对大鼠骨髓细胞的DNA合成功能的影响。方法：采 用 H—TdR掺入的方法对慢速和玻璃化冻存后的大鼠骨髓细胞DAN合成功能进行比较。结果：慢速冻存1 d、 5 d、10 d、20 d与新鲜对照相比，在DAN 合成功能上差异无显著性；而玻璃化冻存组与慢速冻存组相比，短期 差异无显著性，10 d后，每分钟脉冲数(c )值显著下降(P<0．01)。结论：常规慢速冻存后的骨髓细胞损伤 较小．DNA合成水平较高；玻璃化冻存在短期内具有一定的可行性。 【Key words】 rat；b0ne cels；slow cryopmservation；vitTificafion；DNA synthes 自从Polge和 1949年首次发现精子可以在含有甘油的培养液中冻存存活以来，随着临床与科研的需要，超低温冻存各种生物材料日益受到重视。迄今为止，各种冻存技术已日趋完善，但对低温损伤机制和生物材料在降温、冻存及复温过程中的变化规律尚缺乏深刻了解。本研究采用常规慢速和玻璃化两种冻存方法，就其对超低温保存大鼠骨髓细胞的DNA合成功能的影响进行了比较，现报告如下。 1 材料和方法 1．1 材料 大鼠为浙江实验动物中心提供的Waster雄性大鼠，体重150～200 g。玻璃化冻存液VS1成分为18．6％ v／v DMSO、15．5％ w／v乙酰胺、9．6％ v／v丙二醇、4．5％ w／v聚乙二醇，浓度占90％ ；慢速冻存液成分为10％ DMSO(v／v)、40％ v／vRPMI．1540，浓度占90％；洗脱液：以RPMI．1640配制 收稿日期：2002—03—12 基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(397043)。 作者简介：陈勇(1970一)，男，浙江温州人，讲师，遗传学硕士。 论 著的1．5 M蔗糖液、以RPMI．1640 配制的0．5 M蔗糖液； H—TdR：中国原子能科学研究所出品。 1．2 方法 1．2．1 大鼠骨髓细胞悬液的制备：Waster大鼠股动脉放血处死，取两侧股骨，用Hank’s液制成骨髓细胞悬液，加肝素(10单位／m1)，经铜网过滤后计有核细胞数。 1．2．2 实验分组 1．2．2．1 新鲜对照组：10％骨髓细胞悬液+90％f MI一164I)。 1．2．2．2 慢速冻存组：10％骨髓细胞悬液+80％RPMI．1640+10％ DMSO(~-甲基亚砜)。 1．2．2．3 玻璃化冻存组：10％骨髓细胞悬液+90％VS1。 1．2．3 冻存、复温、洗脱： 1．2．3．1 常规慢速冻存：慢速冻存组分装为1 mE／管，从室温降至0℃ 15 min，用程序降温仪以1 oc／min降至一60℃，然后以5~C／rain降至一85℃，直接投入液氮保存；37℃水浴复温后，加适量1．5 M蔗糖，再加入0．5 M蔗糖至10 ml，1500 r／rain离心15n 后，去上清液，用RPMI．1640液重新悬浮。 1．2．3．2 玻璃化冻存：用25％ VS1室温预处理15Hlin，再用50％ VS1 0℃处理10 min，然后用100％VS1 0℃处理1O IIlin，分装成0．2 ml／管，直接投入液氮中冻存；37℃水浴复温后，用1．5 M蔗糖液0．8 HIl稀释，室温5 min后再加0．5 M蔗糖稀释至10 Hll，1500 r／rain离心15 min后去上清液，用FuPMI．1640液重新悬浮【 ，引。 1．2．4 存活率检测：用0．5％台盼兰拒染法测定存活率。 1．2．5 培养：将上述三组冻后细胞用RPMI．1640调至1×10 个／ml，加双抗，青霉素100单位／ml，链霉素100 Hll，分别滴加于九十六孔板上，每孔0．3Hll。在5％ CO2、37．2℃培养箱中预培养4 h后，再逐孔加 H．Tdr 10 uci／ml，继续在5％ coz、37．2℃培养箱中培养4 h。 1．2．6 测定每分钟脉冲数(cpm)值：用多头收集器将细胞收集于醋酸纤维滤纸上，自然干燥，把滤纸片置于5‰ ppo甲苯溶液中，LKB 1214液体闪烁计数器测细胞内 H．TdR的掺人量，以cpm表示f 。1．3 统计学处理方法数据采用SPSS 10．0处理，多组资料经方差分析后行Dunnett检验。 2 结果 2．1 慢速冻存与玻璃化法冻存比较见表1。表1表明：慢速冻存骨髓细胞的冻存效果要比玻璃化法冻存好，并且随着冻存时间的延长，这种效果就表现得更加明显。 2．2 同位素检测 经统计处理后，慢速冻存组：方差分析F=2．166，P=0．102>0．05，全组差异无显著性；玻璃化冻存组：方差分析F=42．363，P=0．000<0．01，差异有显著性，各组差异见前表2。表1 慢速冻存、玻璃化法冻存对骨髓细胞存活率的影响(％)Tab．1 The,~,m．rviva／rate ofthe∞ Ⅱs by slow cryopm’*e．rvalion and vitrifi~． tion (％)哪opIe8erv。d孕幔单：* P<0．05表2 慢速冻存、玻璃化冻存不同时间的epm值变化Tab 2 The epm ofthe．oelt,by slow cryopre．’,exved and vitrifie~ed under diferent daysvB h control：* P<0．05 ，* * P <0．01；v8 1 d：△ P <0．05 ，△ △ P <0．01 3 讨论 检测骨髓在冻存过程中的DNA合成功能变化是衡量细胞活力的重要指标之一。本研究采用慢速冻存和玻璃化冻存两种方法，探讨超低温保存对骨髓细胞的DNA合成能力的影响。脱氧胸腺嘧啶核苷(TdR)是合成DNA的前体物质。 H标记的胸腺嘧啶核苷( H．TdR)掺入检测可以反映冻存细胞的DNA合成水平及细胞的增殖能力，是衡量细胞冻存后的DNA损伤程度的指标之一，可间接反映出冻存质量的高低和冻存技术的成败。 实验结果表明：慢速冻存后的大鼠骨髓细胞经 H．TdR掺人检测表明，冻存20 d的骨髓细胞与新鲜对照及冻存不同天数的细胞相比，差异无显著性，冻存20 d的骨髓细胞的cpm值仍为新鲜对照的82．2％。这说明慢速冻存的骨髓细胞其细胞膜的结构、DNA合成水平和细胞增殖能力在冻存过程中都未受到严重影响。 玻璃化冻存的骨髓细胞，其 H．TdR掺入与新鲜对照相比，其cpm值均显著下降，差异有显著性。这表明玻璃化冻存中骨髓细胞受到较大影响，细胞内DNA合成水平下降、增殖能力降低，因此cpm值下降明显。但在较短时间(1—10 d)内玻璃化法冻存后细胞存活率仍较高，这表明冻存中细胞虽损伤较大但并不致死，因此仍具有一定可行性。 骨髓细胞冷冻损伤后在适当条件下，多数骨髓细胞的活力可以保存、恢复。这在我们的实验中得到证实。从冻存结果看，在较短时期内，慢速冻存与玻璃化冻存差异不明显。采用玻璃化冻存不需程序降温仪，因此更简便易行，具有一定实用价值。 玻璃化法是超低温保存的新技术，不仅操作方法简便，而且冻存效果好，是近年低温生物学领域发展最快的研究方向之一。玻璃化法超低温保存时细胞需在高浓度且低毒的冷冻保护剂中脱水到合适程度，然后，通过快速降温，实现胞内、胞外均玻璃化。 这是玻璃化法与其他传统超低温保存技术的主要区别。因此，从理论上讲，保护剂处理这一阶段是影响细胞存活的最重要环节。 一26 — 维普资讯 在我们过去的研究中，正确的保护剂处理必须既保证细胞充分脱水，又防止高渗所产生的化学和物理毒害。在化冻过程中，细胞内易产生重冰晶，重冰晶损伤在缓慢化冻的过程中更为明显，因此，玻璃化冻存的样品一般采用快速化冻的方法_5 。化冻后的洗涤一般是用高渗的培养基洗去样品中的保护剂成分，以减轻细胞损伤。 本实验结果表明，玻璃化法超低温保存动物样品虽效果不如慢速冻存法，但如能通过增加预培养、保护剂处理前的过渡等方法提高存活率，该技术的方便、快速在未来必有广泛的应用前景。 参考文献： ⋯ P0I C，sIIlitll AV，Park As． vival of 玎nat0z0a出 血 (丑一n aIlI|deIIydr 0n 址low t唧啪h 【J]．N血l ，1949，164(4172)：( ． [2] R且Il ，rally GM．Ice—fln crynpresemti0n 0f rIl0u 口 Jy∞at一196c by、，i嘶( 0n[Jj．Nahlre，1985，313(6003)：573—575． [3] Fa}Iy GM，Levy DI， SE．s0 咖g p~ ples dph caI pmF ，bi010gkal acd0ns，and u曲哆0f fi~ cafion s0Iu一~ns[J]．cry0b l0 ，19{j7，24(3)：1％1． [4] 刘鼎新，吕证宝．细胞生物学研究方法与技术[M]．北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990．1(13—1n5． [5] 王君晖，黄纯农．玻璃化法一园艺植物茎尖和分生组织超低温保存的新途径EJ]．园艺学报，1994，21(3)：277—282． (本文编辑：胡苗苗) |
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