影响骨形成和吸收的生长因子及细胞因子

汪洋

骨骼体积是由骨形成与骨吸收的相对比例来决定的，新近的研究表明，生长因子通过刺激成骨细胞的增殖及其活性，调节局部骨生成作用。现已从骨基质和骨细胞及骨器官培养基中分离出多种BDGF，如：BMP、TGF-β、FGF、PDGF及IGF等，骨细胞培养基中同时还存在造血细胞因子，如粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF、granulocyte-macrophage CSF, GM-CSF)。这些骨源性生长因子有着不同的生物活性，主要有：致有丝分裂作用、分化作用、趋化作用以及溶骨活性。事实证明，骨细胞产生一定量的生长因子贮存于细胞外基质中。此外，骨细胞还分泌出因子作用于其相邻的成骨细胞(旁分泌作用)及其自身(自分泌作用)。骨吸收时，贮存于骨基质中的生长因子得以释放，作为迟缓性旁分泌因子，刺激成骨细胞前体的增殖。由此可见骨生长因子对于局部成骨有着重要作用。??

一、骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)?

(一) BMP的分离提纯?

1889年Senn首次将脱矿骨用于修复人及狗的炎性骨缺损，于1931年Huggins发现泌尿道表皮可异位诱导新骨形成，首次报道了骨诱导实验。1945年Lacroix将醇酸处理骨质后的提取物，植于兔肌肉内，发现此提取物可诱导兔肌肉异位成骨，并称此提取物为“成骨素”，报道了骨诱导现象。1965年Urist首先报道用0.60 mol/L盐酸制备的脱钙骨基质(decalcified bone matrix， DBM)可诱导肌组织等骨骼以外部位组织的间充质细胞转化为骨系细胞。DBM之所以能使间充质细胞转化为骨系细胞，Urist认为这是因其含有BMP的缘故。此后二十余年，Urist等为从骨组织中提纯BMP进行了一系列研究。他们先制备出一种比DBM具有更高诱导活性的骨基质明胶(bone matrix gelatin，BMG)，后经多次实验摸索，于1982年从牛骨BMG中的提取出纯度较高，且具有诱骨活性的牛骨形态发生蛋白(bovine BMP, bBMP)。于1987年Urist建立了一套从人及牛骨中提取BMP的标准步骤。目前，已从牛、猪、羊、马、兔、鼠等动物和人的正常骨组织、骨肉瘤及牙齿中提纯了BMP，并对不同种属间的BMP的结构特点及性质进行了比较性研究，发现不同种属间的BMP具有高度的同源性(表3-2)。

　

表1　Urist方法提取的BMP的性质

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(五) BMP基因染色体定位?

　

表6　　BMP基因的染色定位

BMP1　　　　　　　　8 　　BMP2　　　　　　　　20 　　BMP3　　　　　　　　4p14.3-q21 　　BMP4　　　　　　　　14 　　BMP5　　　　　　　　6 　　BMP6　　　　　　　　6 　　BMP7　　　　　　　　20

　

Tabas等利用体细胞杂交株，用cDNA探针杂交技术确定了BMP1、BMP2、BMP3和BMP4基因在染色体上的位置。BMP1位第8号染色体，BMP2位第20号染色体p12区，BMP3位第4号染色体p14.8-q21区域，BMP4位第14号染色体上。研究表明,BMP2、BMP3和BMP4的基因图谱位于小鼠和人的保守区域，而BMP1则不尽然，还发现BMP1基因与多发性遗传性骨软骨瘤病(multiple hereditary osteochondromatosis)的基因位点相重叠，BMP2、4基因与心-手综合征(Holt-Oram Syndrome)及进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressia， FOP)等遗传疾病的基因位点相重迭。BMP3基因与二型牙本质发育不良(dentinogenesis imperfecta type Ⅱ)的基因位点相重迭。?

汪洋

2. 在胚胎发生中的作用：

TGF-β家族多数成员在胚胎发育的不同阶段都有作用。BMP除了诱骨活性外，在胚胎发育过程中也起着重要作用。

胚胎学以往的研究认为在胚胎发育早期背侧中胚层是由腹侧诱导发生的。1994年日本学者将小鼠BMP２及BMP４受体基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶的段落切除，截短的基因产物仍能与BMP２或BMP４结合，但失去传导BMP信号的功能。将此截短的基因引入胚胎腹侧的细胞中表达，结果腹侧竟转化为背侧中胚层，使胚胎形成第二体轴，这表明内源性BMP2或BMP4参与了胚胎背—腹侧的转化，而背侧的转化需要特定信息的诱导，没有这个信号就不能从腹侧转化出来。1995年有研究报道可能是激活素A介导背侧中胚层、而BMP４在原肠胚腹侧表达，介导腹侧中胚层（包括造血前体）的发生。?

在肢芽、面部原基发生和发育期间BMP２、BMP４表达在时间和空间上的分布及其作用也有详细的报道。?

BMP２、BMP４能潜代ＤＰＰ在果蝇胚胎发育中的重要作用。1994年Graff等从非洲爪蟾中获得了对BMP２或BMP４有高亲和力的受体，在爪蟾胚胎不同部位均有表达，在诱导中胚层的发生中起重要作用。从海胆中也克隆了一个新基因，命名为univin，其编码蛋白质与BMP相似，在胚胎发育期间高表达。可见BMP家族在脊椎和非脊椎动物、以至昆虫、棘皮动物的胚胎发育和细胞分化中都起作用，在动物界的作用具有广泛性。?

３. 在神经发育和修复中的作用：

1994年美国报道了BMP２、BMP６和激活素A在交感神经元中有表达。1995年Tomizawa等描述了BMP6 mRNA在大鼠、沙土鼠脑表达的时间和空间图像。Northern blot显示大鼠从出生到生后３周内BMP６表达特别高，原位杂交表明新生小鼠大多数神经元内都有高水平的BMP6 mRNA，其后除海马区外其他区域神经元中BMP６下降，结论是BMP６是神经元特有的，在神经元的成熟和突触的形成上起重要作用。

培养的小鼠胚胎细胞能分化为星形细胞，表现为形态的改变和Gliel fifbillary acid protein(GFAP)含量的升高，BMP３能抑制培养细胞的增殖、并诱导其分化；BMP２、

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（八）BMP植入后的诱骨活性与免疫应答?

BMP是一种诱导活性蛋白，它植入体内后同样可能由于其诱骨活性决定簇等的存在而引发免疫学方面的问题。过去十年间有限的研究资料表明，BMP确实能引起免疫应答。?

１. 免疫反应现象的证据：

用CyA处理及未处理大鼠所做的实验可以揭示bBMP植入后机体特异性及非特异性免疫反应的情况。在未处理鼠中，部分纯化的bBMP植入后几乎全部出现诱骨活性的“清除”现象，而免疫抑制鼠中则出现高诱骨活性。由于CyA主要是抑制特异性Ｔ细胞介导的体液免疫反应，对照鼠中出现的“清除”现象应归咎于BMP抗体的作用。Urist等曾用ELISA法测定过１０名患严重骨质疏松症患者循环系统中BMP抗体的水平，这些患者与经后期正常妇女相比，体内BMP抗体滴度高，血浆BMP/抗BMP比率低，提示骨质疏松症乃自身免疫功能紊乱所致，也即，BMP抗体的产生阻碍了骨的形成。?

BMP抗体以IgG亚类为主。通常用ELISA或免疫印迹(immunoblotting)来测定循环系统中的BMP抗体。最近的一项研究为BMP IgＧ抗体的骨诱导抑制作用提供了直接的证据：人BMP/ＮＣＰ与相应抗体共育１２h后，其对培养的新生小鼠肌肉组织的诱导活性较对照组明显降低。?

Ｔ细胞在BMP植入后的免疫反应中也起着重要的作用。给切除胸腺的大鼠植入含BMP的脱钙骨基质，２４d后，新骨的形成即骨髓的产生量较对照组多。用免疫组化的方法还观察到骨诱导过程中出现了Ｔ辅助细胞，Ｔ辅助细胞是Ia阳性、最有效的抗原递呈细胞。在骨折的骨痂部位及诱导骨中均可见到Ｉa表达。此外，另一重要的免疫反应标志是诱导骨部位的淋巴细胞表面出现了ＩＬ-２受体。这种种现象均表明细胞免疫参与了机体对BMP的应答。２. 植入同种BMP及其免疫应答：

Mikulski的研究发现，在给远系小鼠植入同种BMP复合物时，用组织学方法可以观察到局部巨噬细胞浸润及淋巴细胞、浆细胞介导的体液免疫反应。这一免疫反应在整体上抑制了骨诱导的发展。研究结果提示BMP免疫反应即使在植入同种移植物时也会不同程度地发生。?

为了在高等脊椎动物体内观察是否有同类现象的发生，有人给羊植入ＴＣＰ、ＩＶ型胶原及部分纯化的羊BMP(sheep BMP, sBMP)的复合物以治疗羊胫骨缺损。与不加BMP的对照相比，１３

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目前关于BMP作用机理提出了如下假说:在发育的早期阶段，BMP作用于间充质细胞(如图示)表面的BMP受体，在一定外界环境的影响下，诱导间充质细胞分化成骨及软骨细胞，一旦间充质细胞成为骨细胞及软骨细胞，BMP的作用即告完成。BMP对成熟的骨及软骨细胞不起作用。骨细胞形成后的生长增殖分化及其功能由其它生长因子调节(PDGF、TGF-β、FGF和TGF-α等)。最近的研究证明，BMP具有抑制破骨细胞生成及其功能发挥的作用，这说明BMP在骨改建中有重要作用。?

(十) BMP与疾病的关系?

1.BMP与骨肿瘤：

在研究骨基质中BMP的同时，人们在骨肉瘤中也发现了类似的诱骨现象。1968年，Heiple发现Dunn骨肉瘤可以通过微孔滤膜诱导新骨形成。Amitani等用脱脂冻干的小鼠骨肉瘤可以诱导异位骨形成，说明在骨肉瘤中存在有诱骨因子。Takaoka和Hanamura等用与从骨基质中提取BMP类似的方法从骨肉瘤中提取得到了一定纯度的BMP。研究BMP与骨肉瘤的关系对进一步了解骨肉瘤的发生、发展与预后有很大帮助。?

Heiple等将小鼠或人骨肉瘤植入小鼠股部或背部肌肉内，2～3周后可诱导出骨组织，其诱骨活性是植入等量正常骨组织诱骨活性的15～17倍。Hanamura将冻干的Dunn骨肉瘤细胞植入小鼠股部肌肉内，两周后肿瘤细胞吸收并由正常软骨、骨及骨髓所取代,新骨生成量与植入的细胞数成正比。由于肿瘤骨组织的骨细胞数量少，钙化不完全，基质疏松，并且不能进行改建形成编织骨或板层骨，且缺乏正常成熟的骨髓腔结构，因而其骨组织形态学与正常骨组织BMP异位诱导生成的骨组织形态学明显不同。Nakahara将从鼠骨肉瘤中提纯的水溶性BMP以牛皮肤明胶或胶原为载体，植于鼠背部的肌肉组织中，发现BMP不仅能诱导肌肉异位骨化，亦使邻近的肋骨骨膜增生，膜内化骨形成骨组织。

汪洋

二、β-转化生长因子(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)?

(一) 概述?

1978年，De Larco和Todaro报道：由Moloney肉瘤病毒转化的小鼠3T3细胞产生多肽生长因子，即肉瘤生长因子(sarcoma growth factor)。这种因子出现在细胞外培养基中，有着不同寻常的功能，即能诱导非肿瘤“识别”细胞(reader cell)，如正常大鼠肾成纤维细胞(normal rat kidney fibroblast, NRK细胞)“转化”表型。这种转化表型的特征是：在单层培养中失去密度依赖性生长，呈单层过度生长，细胞形态呈特征性改变。最重要的是，它能使NRK 49F成纤维细胞在软琼脂培养中呈非静态生长(anchorage independent growth)。肉瘤生长因子对NRK细胞的转化活性为可逆性，一旦NRK细胞失去肉瘤生长因子的作用，则又可返回其原有的细胞形态和正常生长功能。Todaro和Ozanne等报道：在几种人癌细胞和由Kirsten肉瘤细胞病毒转化的鼠细胞中发现有类似转化活性的因子。这些因子都有共同的特征，即能与EGF竞争细胞表面膜受体。?

由于认识到具有类似活性的多肽可以从多种不同的肿瘤细胞中提取，Roberts等开创用酸性乙醇从肿瘤细胞中抽提转化多肽，转化生长因子也由此得名。人们发现，小鼠各种正常组织中均可提取TGF活性物质，尤其是加入EGF进行活性检测时均表现出转化活性的特征，而EGF本身则不能诱导转化。这表明，这些多肽代表着一类新的TGF：可以从非肿瘤组织中提取，在EGF参与条件下促进NRK 49F细胞在软琼脂中生长。不久，在正常血清和血小板中也发现有类似性质的多肽。?

以NRK 49F细胞作为活性检测细胞，可将TGF区分为两类：能与EGF竞争受体，不需要EGF参与即可促进NRK 49F细胞呈克隆生长者，称为TGF-α，不能与EGF竟争受体，需要EGF参与才能促进NRK 49F细胞在软琼脂中生长，称为TGF-β。此外还发现，在同一NRK系统中，EGF本身不能促进NRK 49F细胞在软琼脂中的克隆生长。因此，肉瘤生长因子的转化活性是EGF与TGF-β共同作用的

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(五)TGF-β的生物学作用?

1. 促进细胞增殖：TGF-β在琼脂培养中能刺激非转化成纤维细胞呈非静态性生长，但已证实只有少数间充质细胞和成骨细胞经TGF-β处理后能真正发生增殖反应。在体外，低浓度的TGF-β即可促使成骨细胞自身合成并释放TGF-β，说明骨组织内存在某种自分泌生长调节机理，且可能与骨改建过程有关。?

TGF-β对大多数间充质细胞的增殖作用取决于细胞类型、培养条件以及有无其他生长因子的参与。TGF-β促进NRK成纤维细胞在琼脂培养中生长，但抑制其在单层培养中生长。在有EGF参与的条件下，TGF-β可以促进NRK成纤维细胞呈克隆生长，加速细胞分裂过程。

2. 调节细胞分化：TGF-β在不同条件下，对成骨细胞及成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重调节作用。1～10ng/ml浓度的TGF-β可诱发大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成其特异性的Ⅱ型胶原及硫酸软骨素；在0.40nmol/L浓度下，TGF-β可降低大鼠颅盖骨成骨细胞碱性磷酸酶的活性，减少成软骨细胞Ⅱ型胶原以及硫酸软骨素的合成，此二种细胞亦由圆形或多角形转化为长形的成纤维细胞。另有研究表明，TGF-β抑制培养中兔软骨细胞的终末分化及钙化，而对鼠骨肉瘤成骨细胞的分化有促进作用。大量研究结果表明，TGF-β可能与多种因子如细胞外基质和其他分化调节生长因子一起协同参与对细胞分化的调节。与其对细胞增生的作用方式相似，TGF-β在细胞对其他各种分化信号的应答过程中同样也起调节作用。?

3. 促进细胞外基质合成：TGF-β可以直接刺激成纤维细胞外基质的合成，并对其新合成的基质降解有显著抑制作用。实验发现，TGF-β能促进成纤维细胞对胶原及纤维粘连素的合成。用低于100pg/ml浓度的TGF-β刺激NRK成纤维细胞，6h内即可观察到其胶原含量有显著增加。10ng/ml的TGF-β可使培养中牛软骨基质糖蛋白合成增加七倍。对于成骨细胞，TGF-β可促进其合成I型胶原、骨粘连素和骨桥蛋白(osteopontin)。?

TGF-β诱导成骨细胞和成纤维细胞的细胞外基质蛋白的合成是通过与核因子I(nuclear factor-I, NF-I)相结合所致，其基因表达是通过NF-I结合部位所介导。TGF-β在细胞外基质形成过程中起着重要作用。研究发现，TGF-β除刺激鼠颅盖骨细胞产生胶原以外，还能刺激其产生多种基质蛋白，如纤维粘连素、基质糖蛋白以及骨粘连素。这些基质蛋白的生成是通过NF-I

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三、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Facotor, FGF)?

FGF最初是从脑垂体及大脑中提取的能够刺激NIH 3T3细胞生长的一类蛋白质，后于骨组织及非骨性其它组织中提取获得成功。FGF的分子量为16～17KU，根据等电点的不同又将FGF分为两种: 酸性成纤维细胞生长因子(acid FGF, aFGF，pI=5.6)和碱性成纤维细胞生长因子(basic FGF, bFGF,pI=9.6)。它们与肝素有高亲和力，因此常用肝素凝胶过滤进行提取与纯化。二者虽编码基因不同，但氨基酸序列具有同源性，生物活性相似。在人及牛骨中，bFGF的含量是aFGF的10倍多。现已证实，骨细胞合成FGF，然后贮存于骨基质中，以备后用。FGF可刺激细胞的趋向移动、增殖和分化，FGF通过各种细胞的膜表面受体促进血管内皮细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌细胞、成骨细胞的有丝分裂与增殖，增加合成胶原的细胞的数量，促进骨胶原蛋白及非胶原蛋白的合成，增加骨钙素的合成。在小鼠骨肉瘤细胞系内，促使TGF-β的合成，但降低腺苷酸环化酶的活性和碱性磷酸酶的活性，抑制DNA的合成。一般认为，创伤后细胞损伤或死亡，细胞膜破裂后FGF才得以释放，参与骨愈合早期阶段。?

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四、血小板衍生性生长因子(Platelet-derived Growth Factor, PDGF)?

PDGF是一个具有双链结构的蛋白多肽，分子量为30KU，是血小板分泌的主要丝裂原，是一个极为重要的、随血循环而行、作用于间充质细胞的生长因子。它直接促进正常细胞的增殖和分化。1987年发现成骨细胞亦可合成PDGF，它在骨基质中的含量为50μg/g骨。现已证明，PDGF是两条链组成的三种结构，PDGF虽有三种不同的结构，但它们的生物活性基本相同。研究发现PDGF可刺激骨膜成纤维细胞、骨祖细胞及成骨细胞的DNA合成和细胞的分裂复制，但缺乏特异性。PDGF促进成骨细胞合成胶原及非胶原蛋白，但对骨钙素的合成则无刺激作用。PDGF亦可增加骨质吸收和胶原的降解，因此其生物作用呈双相性。PDGF同IGF-Ⅰ合用时，PDGF拮抗IGF-Ⅰ的促胶原合成作用，IGF-Ⅰ又使PDGF的促胶原降解作用得以抑制，从而维持胶原合成含量的稳定。PDGF是在创伤部位血液凝固过程中释放的，同时成骨细胞亦合成PDGF，促使新生血管形成及骨细胞复制，而参与骨折早期修复。?