生物体的深低温保存技术研究进展

生物体的深低温保存技术研究进展
                    
何  波1，2*，段永壮1，王增涛1

（1山东省立医院，山东济南 250021；2山东大学）

[关键词] 低温保存；生物体

[中图分类号]  R318.52；R454.5  [文献标识码] A  [文章编号]1002-266X（2007）

      近年来，低温保存技术的应用越来越广泛。低温可以降低细胞的呼吸代谢作用，延缓其功能的丧 失，鉴于临床上将生物组织或器官采用特殊方法冷却至深低温，并长期保存；待需要时，再将其按特殊方法复温，以便获得活的生物体。应用于手术将1例患者的离 断手指通过程序降温在-196℃液氮中保存81天后再植成功，足以证明生物材料可以在低温下长期存活[1]。
      1低温保存方法
      将拟冻存的组织或器官过渡到深低温环境中有以下两种方法。
      1.1 快速降温冷冻法   又称“玻璃化低温保存法”。把抗冻处理后的生物材料加标密封后，迅速投放到大口径液氮罐内，以2160℃/min[2]的速度迅速降温至－196℃。有两 条途径可使溶液玻璃化，一条是极大地提高冷却速率，另一条是增加溶液的浓度。当抗冻剂二甲亚砜（DMSO）浓度为40～60%时，较容易形成玻璃态；但在 室温下，这样高的浓度会对细胞产生剧烈的损伤。因此，设法提高冷却速率或寻找容易实现玻璃化而对细胞损伤较小的溶液－“玻璃化溶液”[3] 甚为重要。
1.2“两步法”慢速降温冷冻法   是指将抗冻液处理的生物材料，分两个步骤由室温降至液氮温。第一步是先慢速冷却至中间的某一温度；第二步是将其直接置入液氮，其冷却速率相应的较高些。这两种方法均可以较好地实现均匀降温。
      2抗冻剂和保存液
一 般的生物体在没有添加抗冻剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以，生物体低温保存时离不开抗冻剂。合理选择抗冻剂和配置合适的抗冻液，对低温保存至 关重要[4，5]。此外，为了保持离体细胞、组织和器官的活力，延长其寿命，提供其所需的营养和生活环境，人们模拟其体液或胞内液，配置了各种各样的保存 液，通过保存液稀释抗冻剂，形成所需的抗冻液浓度。
      抗冻剂大致有4类：①低相对分子质量可渗透性保护剂：如DMSO等。②低分子不可渗透物质：如蔗糖等。③大分子保护剂：如聚乙烯吡咯（PVP）等；④混合 保护剂。由于单一的抗冻液各有优缺点，不能满足生物材料的冷冻保存的多方面要求，所以抗冻剂一般都是按一定配方混合使用的。
抗冻剂具有保护作用， 也有一定的毒性。可能为通过细胞膜引起的渗透性损伤（物理性损伤）所致，也可能为与蛋白质和（或）脂膜结合，使之变性（化学性损伤）所致。这些损伤与温 度、防冻剂的含量有关。目前对于混合防冻剂的研究较多，其目的主要是寻找对相应细胞与组织具有最佳保护效果最小毒性的不同含量与种类防冻剂的组合，以发挥 最佳的深低温保护特性，提高复温后细胞的存活率。
      3降温速率
      冷却过程中细胞受损伤有以下两因素假说[6]：一是胞内冰的形成，由过快冷却所产生的；冷却速率越快，此损伤越大。另一是“溶液损伤”，由过慢冷却所产生，使细胞在高浓度溶液中暴露时间过长而遭损伤，冷却越慢，此损伤越大。
      玻璃化就是组织水过冷到玻璃化转变的温度，由于玻璃化低温保存法的冷冻速度很快，来不及形成点状、管状、网状的结晶，类似于一种玻璃样液态，故称为玻璃化 状态。这样可有效避免大颗粒及细胞高渗状态对细胞的损伤[7]。在此状态下,由于分子的运动受到高度的束缚,物质的结构、成分可长期保持稳定不变[8]。 多数学者认为，玻璃化是生物材料长期深低温保存最有前途的方法[9，10，11]。一般来说，细胞和组织只能在稀溶液内存活；而要使稀溶液实现全部玻璃 化，需要极高的冷却速率，如102 ℃/s、103 ℃/s。当然，由于热容量的关系，欲使较大的物体达到超快速的冷却速率仍然是极困难的。
      而在慢速冷冻过程中，以上两种因素损伤不可忽略。针对不同的细胞和不同的低温保护溶液,存在着数值各不相同的最佳降温速率（即两个因素最好的配合）。若降 温速率过快，则在细胞内形成冰晶，这些胞内冰在复温过程中会产生结晶而使细胞损伤；若降温速率过慢，则细胞收缩过剧，并且细胞处在高浓度溶液中的时间过长 而引起损伤。对于不同种类的细胞，最佳冷却速率可相差极大，因为这取决于水分渗透过程是否能跟上降温速率，取决于细胞的表面积与体积之比，以及膜的渗透 率。一般来说，结构越简单的小细胞，最佳冷却速率较高，可达103℃/min或更高；而结构复杂的大细胞，其最佳冷却速率只有每分钟零点几度到几度 [12，13]。
      4生物材料的复温
      与冷却过程相比，复温过程的研究显得薄弱。一般建议，如冷却过程的速率较快，那么相应的复温速率也要快些，这样可获得较好的效果。严格地讲，正确的复温过程应是冷却过程的函数，应针对不同的冷却过程选择不同的复温过程。
       关于形成胞内冰的过快冷却过程和复温过程，其结论是胞内冰的形成不一定会对细胞产生致命的损伤，但若在复温过程中复温速率过慢，使胞内冰发生再结晶的变化，则对细胞是致命的损伤[14]。
       5相关仪器和设备
       根据降温及控制原理降温仪可分为两类：液氮喷射式降温仪、利用液氮容器内气相区温度梯度的升降式降温仪。按近代低温生物学理论，实现低温保存的最困难、最 危险的温度区域是0～－60℃。活细胞被损伤就是发生在这个温度区域内的降温和复温过程。因此，降温仪的温度控制范围至少是从室温到－60℃[ 15，16]。当然，若在室温到-196℃整个区域内能实现温度的精确控制，那就更理想了。
       低温生物显微镜可以控制生物体温度在一定范围内任意变化，直接观察和摄录生物体在冷冻、复温过程中的形态变化[17，18]，以及溶液相变的仔细的观察过 程；再结合图像处理技术，可以对冷冻和复温过程进行定性和定量研究。这对于确定最佳的降温、复温程序以及生物体在冷冻、复温过程中的损伤机理等有很大帮 助，因而被看作是低温生物学研究的最重要、最基本的设备之一。
6低温保存技术的几个问题和前景
      低温保存技术的发展，在许多新的领域具有很大的发展空间和潜力[19]。但也有许多关键环节需要更深入的探讨。
      细胞内外冰晶的形成是造成细胞或组织深低温保存过程中损伤的一个主要因素。有研究发现，微波和一定浓度的深低温保护剂相互结合可以明显减少冰晶形成，提高 慢降温冷冻保存中潜在的玻璃化。而如果将微波技术和乙烯乙二醇结合应用，可以更进一步降低冰晶的形成量。这说明，微波辐射和低温保护剂联合应用是一种控制 细胞和（或）组织在降温过程中冰晶形成，增加生物材料的玻璃化程度的一种有效的方法。微波技术在低温生物学领域应用，有希望会为细胞组织，甚至器官(肢 体)的深低温保存技术，带来新的突破[ 20，21，22]。器官(肢体)的深低温保存目前没有取得大的突破,这与大体积生物系统的传热传质的局限性有关，同时还存在着器官中各个细胞或组织成分 低温生物学特性的巨大差异，因此在选择降温冷冻方法和深低温保护剂方面更为复杂困难，是深低温保存技术需要攻克的难题之一[ 23，24]。相信随着对细胞低温损伤机理认识的逐步加深，在低温生物学研究领域内，多细胞系统的低温损伤和低温保存的机理和模型的研究和确立以及研究和 发现新型低温保护剂的作用机理，都是低温生物学未来研究的热点和焦点。